Etude de Chimie

Calcul de l’activité enzymatique

Calcul de l’Activité Enzymatique en Biochimie

Calcul de l’Activité Enzymatique en Biochimie

Comprendre le Calcul de l’Activité Enzymatique

L'activité enzymatique est une mesure de la quantité d'enzyme active présente dans un échantillon et de sa capacité à catalyser une réaction spécifique. Elle est généralement exprimée comme la quantité de substrat transformé (ou de produit formé) par unité de temps, dans des conditions définies de température, de pH et de concentration de substrat. Le calcul de l'activité enzymatique est fondamental en biochimie pour caractériser les enzymes, étudier leur cinétique, et pour des applications diagnostiques ou industrielles.

Données de l'étude

On étudie l'activité de la lactate déshydrogénase (LDH). Cette enzyme catalyse la réaction réversible :

\[\text{Pyruvate} + \text{NADH} + \text{H}^+ \Rightarrow \text{Lactate} + \text{NAD}^+\]

L'activité est mesurée en suivant la diminution de l'absorbance du NADH à 340 nm. Le NADH absorbe la lumière à cette longueur d'onde, tandis que le NAD⁺ n'absorbe pas de manière significative.

Conditions expérimentales et données :

  • Enzyme : Lactate Déshydrogénase (LDH)
  • Coefficient d'extinction molaire du NADH (\(\varepsilon_{\text{NADH}}\)) à 340 nm : \(6220 \, \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}\)
  • Trajet optique de la cuve (\(l\)) : \(1 \, \text{cm}\)
  • Volume réactionnel total dans la cuve (\(V_{\text{total}}\)) : \(3.0 \, \text{mL}\)
  • Volume de la solution enzymatique ajouté à la cuve (\(V_{\text{enzyme}}\)) : \(0.1 \, \text{mL}\) (soit \(100 \, \mu\text{L}\))
  • Dilution de la solution enzymatique mère (si applicable) : La solution enzymatique utilisée a été diluée 10 fois avant d'être ajoutée à la cuve.
  • Température de la réaction : \(25 \, ^{\circ}\text{C}\)
  • pH de la réaction : \(7.4\)

Mesures d'absorbance à \(A_{340}\) en fonction du temps :

Temps (\(\text{min}\)) Absorbance (\(A_{340}\))
01.250
11.150
21.050
30.950
40.850
Schéma : Suivi Spectrophotométrique d'une Réaction Enzymatique
Source Lumineuse Cuvette S + E → P E S Détecteur A = εcl Mesure de l'Absorbance

Principe du suivi de la réaction par spectrophotométrie.

Questions à traiter

  1. Calculer la variation d'absorbance par minute (\(\Delta A_{340}/\text{min}\)) à partir de la portion linéaire de la courbe.
  2. Calculer la vitesse de la réaction (\(v\)) en termes de variation de concentration de NADH par minute (\(\Delta [\text{NADH}]/\text{min}\)), exprimée en \(\text{M/min}\).
  3. Calculer l'activité enzymatique dans la cuve en Unités Internationales (UI). (Rappel : \(1 \, \text{UI} = 1 \, \mu\text{mol}\) de substrat transformé par \(\text{minute}\)).
  4. Calculer l'activité enzymatique volumique de la solution d'enzyme diluée utilisée dans l'essai, exprimée en \(\text{UI/mL}\).
  5. Calculer l'activité enzymatique volumique de la solution d'enzyme mère (avant dilution), exprimée en \(\text{UI/mL}\).

Correction : Calcul de l’Activité Enzymatique

Question 1 : Variation d'absorbance par minute (\(\Delta A_{340}/\text{min}\))

Principe :

La vitesse de la réaction enzymatique peut être suivie par la variation de l'absorbance (\(\Delta A\)) d'un substrat ou d'un produit chromophore au cours du temps (\(\Delta t\)). On recherche la pente de la partie linéaire de la courbe Absorbance vs. Temps. Dans cet exercice, l'absorbance diminue car le NADH est consommé.

Formule(s) utilisée(s) :
\[ \frac{\Delta A}{\text{min}} = \frac{A_{\text{initial}} - A_{\text{final}}}{t_{\text{final}} - t_{\text{initial}}} \quad (\text{pour une diminution}) \]

Ou plus précisément, la pente de la régression linéaire si plusieurs points sont disponibles.

Données spécifiques :

Les données d'absorbance montrent une diminution linéaire :

  • \(A_0 = 1.250\) à \(t_0 = 0 \, \text{min}\)
  • \(A_1 = 1.150\) à \(t_1 = 1 \, \text{min}\)
  • \(A_2 = 1.050\) à \(t_2 = 2 \, \text{min}\)
  • \(A_3 = 0.950\) à \(t_3 = 3 \, \text{min}\)
  • \(A_4 = 0.850\) à \(t_4 = 4 \, \text{min}\)

La diminution est constante : \(0.100\) unités d'absorbance par \(\text{minute}\).

Calcul :
\[ \begin{aligned} \frac{\Delta A_{340}}{\text{min}} &= \frac{A_{t=0\,\text{min}} - A_{t=1\,\text{min}}}{1 \, \text{min} - 0 \, \text{min}} \\ &= \frac{1.250 - 1.150}{1 \, \text{min}} \\ &= \frac{0.100}{1 \, \text{min}} \\ &= 0.100 \, \text{min}^{-1} \end{aligned} \]

Ou, en considérant l'ensemble des points pour confirmer la linéarité :

\[ \begin{aligned} \frac{\Delta A_{340}}{\text{min}} &= \frac{A_{t=0\,\text{min}} - A_{t=4\,\text{min}}}{4 \, \text{min} - 0 \, \text{min}} \\ &= \frac{1.250 - 0.850}{4 \, \text{min}} \\ &= \frac{0.400}{4 \, \text{min}} \\ &= 0.100 \, \text{min}^{-1} \end{aligned} \]

La variation d'absorbance est donc de \(0.100\) par \(\text{minute}\) (valeur absolue de la pente, car l'absorbance diminue).

Résultat Question 1 : La variation d'absorbance est \(\Delta A_{340}/\text{min} = 0.100 \, \text{min}^{-1}\).

Quiz Intermédiaire 1 : Si l'absorbance augmentait avec le temps, cela signifierait que :

Question 2 : Vitesse de réaction (\(v\)) en \(\Delta [\text{NADH}]/\text{min}\)

Principe :

La loi de Beer-Lambert (\(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\)) relie l'absorbance (\(A\)) à la concentration (\(c\)) d'une substance, son coefficient d'extinction molaire (\(\varepsilon\)), et le trajet optique (\(l\)). On peut donc convertir la variation d'absorbance par minute en variation de concentration par minute.

Puisque \(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\), alors \(\Delta A = \varepsilon \cdot \Delta c \cdot l\). Donc, \(\Delta c = \frac{\Delta A}{\varepsilon \cdot l}\).

Formule(s) utilisée(s) :
\[ v = \frac{\Delta [\text{NADH}]}{\text{min}} = \frac{\Delta A/\text{min}}{\varepsilon_{\text{NADH}} \cdot l} \]
Données spécifiques :
  • \(\Delta A/\text{min} = 0.100 \, \text{min}^{-1}\)
  • \(\varepsilon_{\text{NADH}} = 6220 \, \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}\)
  • \(l = 1 \, \text{cm}\)
Calcul :
\[ \begin{aligned} v &= \frac{0.100 \, \text{min}^{-1}}{6220 \, \text{M}^{-1}\text{cm}^{-1} \cdot 1 \, \text{cm}} \\ &= \frac{0.100}{6220} \, \text{M/min} \\ &\approx 0.000016077 \, \text{M/min} \\ &\approx 1.6077 \times 10^{-5} \, \text{M/min} \end{aligned} \]

Exprimé en \(\mu\text{M/min}\) : \(1.6077 \times 10^{-5} \, \text{mol/L/min} \times 10^6 \, \mu\text{mol/mol} = 16.077 \, \mu\text{M/min}\).

Résultat Question 2 : La vitesse de réaction est \(v \approx 1.608 \times 10^{-5} \, \text{M/min}\) (ou \(16.08 \, \mu\text{M/min}\)).

Quiz Intermédiaire 2 : Le coefficient d'extinction molaire (\(\varepsilon\)) dépend :

Question 3 : Activité enzymatique dans la cuve (UI)

Principe :

Une Unité Internationale (UI) d'activité enzymatique est définie comme la quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de \(1 \, \mu\text{mol}\) de substrat par \(\text{minute}\) dans des conditions spécifiées. Pour calculer cela, on multiplie la vitesse de réaction (en \(\mu\text{mol/L/min}\) ou \(\mu\text{M/min}\)) par le volume réactionnel total dans la cuve (en Litres).

Formule(s) utilisée(s) :
\[ \text{Activité (UI)} = v \, (\mu\text{mol}/\text{L}/\text{min}) \times V_{\text{total}} \, (\text{L}) \]
Données spécifiques :
  • \(v \approx 16.077 \, \mu\text{M/min} = 16.077 \, \mu\text{mol}/\text{L}/\text{min}\)
  • \(V_{\text{total}} = 3.0 \, \text{mL} = 0.003 \, \text{L}\)
Calcul :
\[ \begin{aligned} \text{Activité (UI)} &= 16.077 \, \mu\text{mol}/\text{L}/\text{min} \times 0.003 \, \text{L} \\ &\approx 0.048231 \, \mu\text{mol/min} \\ &\approx 0.048231 \, \text{UI} \end{aligned} \]
Résultat Question 3 : L'activité enzymatique dans la cuve est d'environ \(0.0482 \, \text{UI}\).

Quiz Intermédiaire 3 : Si le volume réactionnel était de 1 mL au lieu de 3 mL (avec la même \(\Delta A/\text{min}\)), l'activité en UI dans la cuve serait :

Question 4 : Activité enzymatique volumique de la solution d'enzyme diluée (\(\text{UI/mL}\))

Principe :

L'activité enzymatique volumique (ou concentration d'activité) de la solution d'enzyme est l'activité totale mesurée dans la cuve rapportée au volume de la solution d'enzyme qui a été introduite dans cette cuve.

Formule(s) utilisée(s) :
\[ \text{Activité Volumique (UI/mL)} = \frac{\text{Activité dans la cuve (UI)}}{V_{\text{enzyme}} \, (\text{mL})} \]
Données spécifiques :
  • \(\text{Activité dans la cuve} \approx 0.048231 \, \text{UI}\)
  • \(V_{\text{enzyme}} = 0.1 \, \text{mL}\)
Calcul :
\[ \begin{aligned} \text{Activité Volumique (diluée)} &= \frac{0.048231 \, \text{UI}}{0.1 \, \text{mL}} \\ &= 0.48231 \, \text{UI/mL} \end{aligned} \]
Résultat Question 4 : L'activité enzymatique volumique de la solution d'enzyme diluée est d'environ \(0.482 \, \text{UI/mL}\).

Quiz Intermédiaire 4 : Pour augmenter la précision de la mesure d'activité, il est généralement préférable de :

Question 5 : Activité enzymatique volumique de la solution d'enzyme mère (\(\text{UI/mL}\))

Principe :

Si la solution d'enzyme ajoutée à la cuve était une dilution d'une solution mère, il faut tenir compte de ce facteur de dilution pour calculer l'activité de la solution mère. L'activité de la solution mère sera plus élevée que celle de la solution diluée.

Formule(s) utilisée(s) :
\[ \text{Activité Volumique (mère)} = \text{Activité Volumique (diluée)} \times \text{Facteur de Dilution} \]
Données spécifiques :
  • \(\text{Activité Volumique (diluée)} \approx 0.48231 \, \text{UI/mL}\)
  • \(\text{Facteur de Dilution} = 10\)
Calcul :
\[ \begin{aligned} \text{Activité Volumique (mère)} &= 0.48231 \, \text{UI/mL} \times 10 \\ &= 4.8231 \, \text{UI/mL} \end{aligned} \]
Résultat Question 5 : L'activité enzymatique volumique de la solution d'enzyme mère est d'environ \(4.82 \, \text{UI/mL}\).

Quiz Intermédiaire 5 : Un facteur de dilution de 10 signifie que :

Quiz Rapide : Testez vos connaissances (Récapitulatif)

6. L'Unité Internationale (UI) d'activité enzymatique correspond à :

7. La loi de Beer-Lambert est cruciale pour :

8. Si une enzyme est très active, on s'attend à ce que \(\Delta A/\text{min}\) soit :

Glossaire

Activité Enzymatique
Mesure de la vitesse à laquelle une enzyme catalyse une réaction spécifique. Souvent exprimée en Unités Internationales (UI) ou en \(\text{katals}\).
Unité Internationale (UI)
Quantité d'enzyme qui catalyse la transformation d'une micromole (\(\mu\text{mol}\)) de substrat par \(\text{minute}\) dans des conditions d'essai spécifiées.
Katal (kat)
Unité SI de l'activité catalytique. \(1 \, \text{kat} = 1 \, \text{mol}\) de substrat transformé par \(\text{seconde}\).
Loi de Beer-Lambert
Relation linéaire entre l'absorbance et la concentration d'une espèce absorbante : \(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\), où \(A\) est l'absorbance, \(\varepsilon\) est le coefficient d'extinction molaire, \(c\) est la concentration, et \(l\) est le trajet optique.
Coefficient d'Extinction Molaire (\(\varepsilon\))
Mesure de la capacité d'une substance chimique à absorber la lumière à une longueur d'onde donnée. Unité : \(\text{M}^{-1}\text{cm}^{-1}\).
Spectrophotométrie
Technique analytique qui mesure la quantité de lumière absorbée ou transmise par un échantillon en fonction de la longueur d'onde.
NADH (Nicotinamide Adénine Dinucléotide Réduit)
Coenzyme important dans de nombreuses réactions d'oxydoréduction cellulaires. Sa forme réduite (NADH) absorbe la lumière à 340 nm, tandis que sa forme oxydée (NAD⁺) ne le fait pas de manière significative à cette longueur d'onde.
Substrat
Molécule sur laquelle une enzyme agit pour la transformer en produit(s).
Produit
Molécule résultant de la transformation du substrat par une enzyme.
Vitesse de Réaction (\(v\))
Quantité de substrat consommé ou de produit formé par unité de temps. En enzymologie, souvent exprimée en \(\text{concentration/temps}\) (ex: \(\mu\text{M/min}\)).
Activité Spécifique
Activité enzymatique par milligramme de protéine totale dans un échantillon (\(\text{UI/mg}\)). C'est une mesure de la pureté de l'enzyme.
Calcul de l’Activité Enzymatique - Exercice d'Application

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